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Elisa實(shí)驗(yàn)洗板前準(zhǔn)備

發(fā)布時(shí)間:2023-05-08    點(diǎn)擊次數(shù):1670

    本生闡述Elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)洗板前準(zhǔn)備流程


  一、ELISA操作前準(zhǔn)備工作

  試劑盒的選擇

  ELISA操作前,應(yīng)做好實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準(zhǔn)備試劑及耗材、處理樣本等準(zhǔn)備工作。

  樣本處理

  在收集標(biāo)本前需有一個(gè)完整的計(jì)劃,需要清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。ELISA檢測提倡新鮮標(biāo)本盡早檢測,對收集后當(dāng)天就進(jìn)行檢測的標(biāo)本,及時(shí)儲存在4℃?zhèn)溆?,如有特殊原因需要周期收集?biāo)本,請取材后,將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實(shí)驗(yàn)質(zhì)量,所以避免反復(fù)凍融。

  二、ELISA標(biāo)準(zhǔn)品溶解

  標(biāo)準(zhǔn)品是試劑盒的檢測抗原的一個(gè)度量標(biāo)尺,因此標(biāo)準(zhǔn)品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細(xì)節(jié):凍干標(biāo)準(zhǔn)品溶解按照說明書的要求,準(zhǔn)確復(fù)溶。在冰上操作標(biāo)準(zhǔn)品為佳,靜止5-10分鐘,輕輕搖勻后按照一次量分裝,在-20度或-70度保存。標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)禁反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋應(yīng)事先做好準(zhǔn)備,如離心管的準(zhǔn)備和編號以及稀釋液的準(zhǔn)備;稀釋時(shí),應(yīng)充分混勻;采用進(jìn)口或者硅化的EP管,減少蛋白吸附。在實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)進(jìn)行倍比稀釋時(shí),注意操作規(guī)范,槍頭勿刮劃預(yù)包被的孔底。

  三、ELISA操作中的洗滌

  洗滌是ELISA實(shí)驗(yàn)中是次數(shù)多的操作,也是非常重要的步驟。不嚴(yán)格的洗滌容易出現(xiàn)洗不干凈或交叉污染現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)重復(fù)效果差的現(xiàn)象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管,還是洗板機(jī),嚴(yán)格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時(shí)間和洗滌次數(shù)。注意標(biāo)準(zhǔn)化操作將減少實(shí)驗(yàn)誤差和不同實(shí)驗(yàn)之間的誤差。操作者常出現(xiàn)洗板不干凈現(xiàn)象,請比照“手工洗板小貼士"操作:

  a)洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定會增高。

  b)特別注意:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候要考慮實(shí)驗(yàn)孔的位置,保證甩掉洗液時(shí),空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開更好。同時(shí)注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補(bǔ)2-3次甩出液體。

  c)用干凈的濾紙,不要用衛(wèi)生紙,因?yàn)榧?xì)小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導(dǎo)致洗板不干凈,結(jié)果偏高或偏低,重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。

  d)每次拍板不要重復(fù)在一個(gè)地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不干凈,拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下,最后一次一定要扣干凈。

  e)不能減少洗液體積、洗板時(shí)間和次數(shù)。洗板時(shí)間太短,洗板效果不佳。延長洗板時(shí)間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。

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