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本生闡述——ELISA試劑盒檢測組織勻漿液有哪些注意事項

更新時間:2023-06-05    點擊次數:1256

  本生闡述——ELISA試劑盒檢測組織勻漿液有哪些注意事項


  介紹

  酶聯免疫吸附測定(ELISA)作為最快速、靈敏、準確可靠的定量分析方法之一,組織樣本的處理和數據的處理方式對于ELISA實驗的成功有著非常重要的作用。ELISA檢測的樣本類型不僅包括常見的血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清,而且包括不常見的尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、精ye、陰道分泌物等。其中組織勻漿、細胞裂解液、糞便、精ye等樣本的收集時間、處理方法和保存的差異,會造成獲得樣品間的蛋白含量差異較大,進而造成后續檢測或數據處理上的一些問題,從而會影響到學者判斷ELISA實驗的結果。下面我們著重介紹一些比較通用的組織勻漿液的制備方法,并通過文獻進行列舉數據處理的方法,以供大家學習借鑒。

  玻璃勻漿器組織勻漿液的制備方法

  用4℃預冷的1×PBS(pH7.2-7.4,0.01M,cell culture)沖洗組織,去除殘留血液,并去除組織上的筋膜、脂肪等冗余組織;

  稱重后將組織用眼科剪刀和鑷子剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:5-1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應5-9 mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,不建議反復凍融超過2次。因為過多的反復凍融可能影響細胞因子含量的穩定性。最后,將組織勻漿液于2-8℃,5000×g離心5-10分鐘,取上清檢測;

  處理樣本的過程就是收集細胞因子或目標蛋白的過程,由于細胞因子或蛋白結構容易改變和降解,組織勻漿過程完成后,儲存也非常重要,特別需要注意的是,不要反復凍融,樣本處理之后可分裝密封保存,4度保存應小于1周,-20 度不應超過3個月,-80度不應超過6個月。在標本使用前應室溫緩慢均衡溶化,不能進行加熱。

  超聲組織勻漿液的制備方法

  提前將剪刀、鑷子用75%酒精消毒,然后用預冷的1×PBS滌浸泡,用來剪切、剪碎組織;

  對應將要提取蛋白的組織編號,然后給EP管編號,放在冰上進行預冷。用預冷的PBS (0.01M,pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液,稱重后將組織剪碎;

  配置裂解液:提前將蛋白酶抑制劑(貨號:P6730)、磷酸酶抑制劑(貨號:P1260)、PMSF(貨號:P0100)分別按照1:100的體積比加入到RIRP裂解液中,快速搖勻后靜置冰上即可;

  將剪碎的組織,加入對應體積的裂解液(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的裂解液,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄);

  在冰上,用剪刀將組織剪碎(剪至組織顆粒非常細小,甚至剪成糜狀物),然后去超聲破碎即可。(超聲的條件:儀器:新芝 Scientz-IID;破碎條件:180W超聲3s關6s,超聲一次時間1min,超聲3-4次);

  超聲破碎完成后,離心(4℃,12000rpm離心30分鐘);

  離心完成后,用移液器吸取上清液至新的EP管中,同時記錄蛋白提取液的體積,然后用BCA法測上清蛋白的濃度。

  組織勻漿液的蛋白定量必要性

  為了避免假陽性的產生ELISA檢測指標眾多,某些組織樣本如肝臟,腎臟,腦組織等,因為細胞內含有的蛋白復雜多變,可能會造成與檢測指標有假陽性反應。所以通過蛋白含量檢測,把高濃度(20mg/mL以上)的樣本進行稀釋至1-2mg/mL,進行判斷是否存在假陽性的可能;

  為了方便后續的數據處理和比較分析

  因為組織塊的大小、提取蛋白的效率不同,所以必然提取的組織勻漿液中蛋白含量在一定的范圍內變化,或者樣本間蛋白含量差異顯著。這些都會造成后續數據處理的困難,無法分辨是因為研究處理的影響,還是蛋白含量造成的差異性。因此,大多數學者會繼續發掘數據的其余方面,例如,處理組與對照組的含量百分比;每克組織勻漿蛋白中細胞因子含量的比較;聯用其余指示性指標進行比較,例如,炎癥反應級別、脂肪率、模型差異等進行聯合比較分析。

  組織勻漿液進行細胞因子檢測的思考

  因為目前檢測細胞因子的類型越來越多,我們也要重新考慮樣本處理適合自己的樣本類型,并且適合自己檢測的細胞因子類型,例如,檢測因子有可能為蛋白酶3(Protease 3)、核糖核酸酶A(核糖核酸酶A)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE/ELA2)等具有酶活性質的細胞因子,在組織勻漿過程中是否添加蛋白酶抑制劑就值得思考;

  一些檢測細胞因子需要酸化激活處理也需要特別注意,例如轉化生長因子-β1(TGF-β1)、肌肉生長抑制素(GDF-8)等,因此在組織勻漿液的pH最好處于6.5-7.5的中性范圍;

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