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本生闡述:牛血清白蛋白的應用
牛血清白蛋白(BSA)在生化實驗中有廣泛的應用, 例如在WB實驗中加入BSA, 通過提高溶液中蛋白質的濃度,對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附,能減輕有些酶的變性,減輕不利環境因素如加熱,表面張力及化學因素引起的變性的。具體的WB實驗操作和BSA在實驗中的應用分享如下
方法/步驟
測定蛋白濃度
按50:1配置BCA工作液。10ulC液(蛋白標準)+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標準液。再分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標準液加入96孔板的第1~8標準孔中,在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。分別加PBS定容至20ul。各孔中加入200ulBCA工作液,室溫放置2小時。用酶標儀測定蛋白濃度:測定A562,依標準曲線算出蛋白濃度。
SDS-PAGE電泳
1 制 膠: 按比例配制分離膠,緩緩地搖動溶液,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水,以阻止氧氣進入凝膠溶液中,靜置40min。同前按比例配制濃縮膠,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分,連續平穩的注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制60min以上以保證*聚合。
2 預電泳: 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。(目的是清除凝膠內的雜質, 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通)。
3 樣品準備:首先計算上樣體積,然后按樣品:上樣buffer=4:1的比例加入上樣bufer混勻,沸水煮10分鐘,冰上5分鐘。
4 加 樣: 預電泳后依次加入標準品(Marker)和待分析樣品。(加樣時間要盡量短,以免樣品擴散,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。每個泳道加5ul 。
5 電 泳: 加樣完畢,選擇80V恒壓進行電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處(一般約20分鐘),更換至100V恒壓電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳(一般約為1小時20分鐘)。
膜的封閉
用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%BSA(abs49001012)封閉液內,搖床震動,70轉/分鐘,室溫封閉1小時30分鐘。
蛋白質的樣品制備
取心肌組織50mg,待組織塊自行溶解,用濾紙吸去其表面水分,將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位,用組織剪盡量將其剪碎,將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),將玻璃勻漿器插入冰中,勻漿約30分鐘。
將心肌組織勻漿轉移到離心管中,4℃12000g離心5分鐘,收集上清(如有粘稠物進一步用超聲處理),樣品分裝凍存于-20℃備用。
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